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光學顯微鏡觀察方式大盤點:霍夫曼調制相襯

發布時間:2024-12-16

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光學顯微鏡觀察方式大盤點:霍夫曼調制相襯


霍夫曼調制相襯(Hoffman Modulation Contrast,簡稱HMC)是ROBERT HOFFMAN教授于1975年提出的一種觀察方式①,是基于斜照明技術加入偏振鏡、狹縫光闌和調制器改進而來的一種透明樣品觀察技術,特點是有三維立體感,且適用于塑料培養皿,有人稱之為“窮人的DIC”,主要用于IVF注射等顯微操作。



MF53-HMC拍攝的卵母細胞


一、成像原理


斜照明成像與明場成像對比②


斜照明(Oblique Illumination)技術又稱離軸照明(Off-Axis Illumination),是一種非常古老的顯微鏡技術,1866年由德國物理學家August Toepler提出③,并由阿貝聚光鏡的發明者Ernst Abbe完善,基本思路是利用偏軸光照射樣品,然后經過透明樣品發生衍射、反射和折射,最終除了未衍射的0級光,還能把一兩個臨近級別的衍射光(1級和-1級)用到成像中,從而提升分辨率和焦深,形成浮雕樣式的立體成像,因此這種觀察方式又稱浮雕相襯(Relief Contrast,簡稱RC)。



標準PH相襯和CK40的RPC斜照明相襯,注意斜照明下整個畫面明暗漸變



斜照明提升分辨率和焦深的原理


斜照明很多地方跟簡易透射暗場相近,只是它的光闌不是環形的,而是半圓或其他狹縫形狀,有更強方向性。題外話一句,極紫外光刻EUV也使用了斜照明技術。



霍夫曼光路結構


霍夫曼調制相襯在斜照明基礎上加入了三個部件,偏振鏡,狹縫聚光鏡和物鏡調制器,使部分衍射光的強度大于背景光,部分衍射光的強度小于背景光,這樣就形成更高對比度的立體成像。


當前霍夫曼調制相襯的專利已經過了保護期,四大品牌都推出了自己的HMC技術,奧林巴斯Evident叫浮雕相襯RC(Relief Contrast,繼承以前RPC的命名),尼康叫高級調制相襯NAMC(Nikon Advanced Modulation Contrast),蔡司叫改進型調制相襯iHMC(Improved Hoffman Modulation Contrast),徠卡叫整合調制相襯IMC(Integrated Modulation Contrast),除了徠卡的是特有的機身調制器取代物鏡調制器,其他跟原始設計差距不大。


二、關鍵部件

典型霍夫曼相襯需要三個部件,偏振鏡,霍夫曼聚光鏡(帶狹縫光闌),霍夫曼物鏡(帶物鏡調制器)。



MF53-HMC的霍夫曼相襯配件


·光源偏振鏡


光源偏振鏡在光源和聚光鏡之間

偏振鏡在光源和聚光鏡之間,相當于一個起偏器,它可以旋轉,旋轉后可以調整成像的立體感和對比度。


·霍夫曼聚光鏡


霍夫曼聚光鏡,注意半透明的狹縫檢偏器

霍夫曼聚光鏡又稱狹縫聚光鏡,一般采用轉盤式設計,按照10X/20X/40X三個倍數有不同的狹縫光闌裝在聚光鏡前焦面,另有留空孔用于明場觀察。


聚光鏡狹縫光闌分為三個部分:占大部分的暗區,不透光;離軸的狹縫,100%透光;狹縫檢偏器,連著狹縫,尺寸跟狹縫相近,旋轉光源偏振鏡會改變這個區域的通光率,可以改變成像立體感和對比度。


注意:由于樣品在起偏檢偏的光路之后,而不是在起偏檢偏之間,因此霍夫曼可以看塑料培養皿和塑料樣品。


簡化版的霍夫曼沒有偏振鏡,狹縫光闌只有暗區和狹縫,沒有狹縫檢偏器。


·霍夫曼物鏡


霍夫曼物鏡會有HMC、PMC、NAMC等標記

霍夫曼物鏡跟相襯物鏡相似,在物鏡后端的后焦平面上嵌入了精密的物鏡調制器,這個調制器不能移動不能取出。



霍夫曼物鏡后端可見三個區域

物鏡調制器分成三個區域:在邊緣的暗區,透射1%光線;狹窄的灰區,透射10-15%光線;透明區,連著灰區,100%透光。


霍夫曼物鏡能用于明場、暗場和熒光觀察,但用在熒光觀察時效果不佳,因為有調制器,其透光率低于普通明場物鏡。


注意:霍夫曼的狹縫光闌和物鏡調制器有很強的方向匹配關系,物鏡擰緊后,需要調整聚光鏡狹縫方向來匹配,非專業人士請不要調霍夫曼物鏡或聚光鏡,否則很難調節回最佳狀態。



IMC可調的狹縫插板,統一的物鏡調制器(IMC/BF文字和孔位相對而非相鄰)


另外整合調制相襯IMC的物鏡調制器設置在了物鏡后焦面的共軛面上,也就是在機身內置而非物鏡內置,因此可以使用霍夫曼物鏡以外的物鏡。但必須提醒的是,IMC是組合消色差設計,物鏡與觀察頭是成套搭配實現消色差的,隨便換物鏡可能破壞消色差設計導致效果不佳。


三、成像特點

霍夫曼調制相襯成像接近DIC微分干涉,并且在使用層面上還有成本更低、工作空間大、可以觀察塑料培養皿等優勢,因此廣泛應用于顯微操作、IVF輔助生殖等領域。



霍夫曼可觀察塑料等各向同性材料,DIC不能④


1、強立體感

霍夫曼可以提高透明樣品的可見性和對比度,圖像有強立體感,效果接近DIC,有利于顯微操作。



霍夫曼拍攝的口腔上皮細胞

2、豐富細節,無光暈

霍夫曼沒有澤尼克相襯的光暈瑕疵,成像邊緣更清晰,且焦深更大,細節豐富。



樣品形狀和方向不同影響了霍夫曼成像畫質

3、強方向性,低可重復性

這是個缺點,霍夫曼觀察的效果與狹縫方向、樣品方向相關。舉例而言,兩臺霍夫曼顯微鏡,物鏡擰緊之后的旋轉角度可能不一致,對應聚光鏡狹縫的角度也會不一致,即便樣品在兩臺顯微鏡之間平移,得出的成像也會有不同,相同原理,同一臺霍夫曼顯微鏡,樣品旋轉角度不同,即便相同區域成像也會不同。這導致霍夫曼等所有基于斜照明的系統都存在可重復性問題,因此論文普遍傾向用更高可重復性的相襯和DIC等觀察方式。


四、主要應用


霍夫曼顯微注射

1、IVF輔助生育

霍夫曼的強立體感和大工作空間,讓它非常適合精密的顯微操作使用,比如在IVF輔助生育領域,霍夫曼可以為卵胞質內單精子注射(ICSI)技術提供成像支持。


2、轉基因研究

類似IVF中的精子注射,在各種轉基因研究中也有類似的原核注射(pronucleus injection)技術,使用霍夫曼可以為顯微操作提供精確的立體成像支持。


五、明美產品推薦

1、顯微操作成像平臺:MF53-HMC/MIX60-HMC

 

  • 成像具有類似DIC的強立體感,適合卵母等透明樣品

  • 成本比DIC更有優勢,適合IVF等規模化使用

  • 帶偏光鏡,可調節成像立體感和對比度

  • 可以滿足較厚透明樣品觀察


①HOFFMAN, R., GROSS, L. The modulation contrast microscope. Nature 254, 586–588 (1975). https://doi.org/10.1038/254586a0

②Pelc, Radek & Hostounsky, Zdeněk & Otaki, Tatsuro & Katoh, Kaoru. (2020). Conventional, Apodized, and Relief Phase-Contrast Microscopy. 10.1007/978-1-0716-0428-1_10. 

③To¨pler A (1866) Ueber die Methode derSchlierenbeobachtung als mikroskopischesHu¨lfsmittel, nebst Bemerkungen zur Theorieder schiefen Beleuchtung. (Poggendorff ’s)Annalen der Physik und Chemie (Leipzig)127(4):556–580. https://doi.org/10.1002/andp.18662030405 [Annalen der Physik (Ber-lin) 203(4):556–580]

④Hoffman, R. (1989). Modulation Contrast and Differential Interference Contrast Techniques. In: Hemsley, D.A. (eds) Applied Polymer Light Microscopy. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-94-011-7474-9_5


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